บทนำเอนไซม NAD kinase (NADK; ATP :

บทนำ
เอนไซม NAD kinase (NADK; ATP : NAD 
2’-phosphotransferase, EC 2.7.1.23) เปน
เอนไซมท พบท ี่ งในเซลล ั้ โปรคาร  โอตและย ิ คาร ู โอต ิ
การศึกษาเอนไซม NAD kinase ในพืชยังไมมี
ขอมูลมากนัก โดยพบวา NAD kinase มีความ
เกยวข ี่ องก  บเมแทบอล ั ซิมของ ึ NAD+ และ NADP+
(Turner et al., 2005) โดย NADP+ สรางจาก
NAD+ โดยใชพลังงาน ATP ผานปฏิกิริยา
phosphorylation (Stryer, 1995) NAD+ และ
NADP+ เปนตัวรับอิเล็กตรอนที่สำคัญในระบบ
เมแทบอลิซึม ควบคุมปฏิกิริยารีดอกซในเซลล
และปองกันเซลลจาก reactive oxygen species
(ROS) โดยพบวาสัดสวนของ NADP+
/NAD+ จะ
เพิ่มขึ้นอยางรวดเร็วกวาสิบเทาในระหวางที่พืช
เกิดโรค (Turner et al., 2005) ในงานวิจัยนี้จะ
ศกษาแอกต ึ วิติของ ี NAD kinase จากขาว (Oryza
sativa L.) ซงเป่ึ นพ ชทื ม่ีความสำค ี ญทางเศรษฐก ั จิ
ของไทย โดยกอนหน  าน ม้ีการศ ี กษา ึ NAD kinase
ใน Arabidopsis พบวาม ความคล ี ายคล  งกึ บั NAD
kinase ที่พบในพืชหลายชนิด เชน มะเขือเทศ
(Lycopersicon esculentum), ขาว, ขาวโพด
(Zea mays) และถั่วเหลือง (Glycine max) และ
พบวาแอกติวิตีของ NAD kinase มีการควบคุม
ของคัลมอดุลิน (calmodulin) รวมดวย (Turner
et al., 2004) การทดลองครั้งนี้ประกอบดวยการ
โคลนยีน NAD kinase1 จากขาวเขาสู pET21a
(+) และสงถายพลาสมิดรีคอมบิแนนตเขาสู
Escherichia coli สายพันธุ Rosetta ตรวจสอบ
การสรางโปรต  นโดยว ี ธิ SDS-PAGE ี และ Western
blot analysis การทำ soluble enzyme ใหบร สิทธุ ์ิ
โดยนิกเกิลคอลัมนและการวัดแอกติวิตีของ NAD
kinase เพอเป ่ื นข อม ลพู นฐานสำค ้ื ญทั ทำให ่ี เข าใจ 
กลไกการทำงานของ NAD kinase
วิธีการศึกษา
การสรางพลาสม  ดริ คอมบ ี แนนต ิ จากย  นี NAD
kinase1 (NADK1)
สบคื นข อม ลของจ ู โนมข ี าวเพ  อหาย ื่ นี NADK1
โดยใชลำดับเบสของยีน NADK1 และลำดับกรด
174 ธันยชนก ดําริหสุข และคณะ
อะมโนท ิ แปลรห ่ี สได ั จาก  Arabidopsis เปน query
นำขอมูลลำดับเบส cDNA ของยีน NAD kinase
ที่ไดมาออกแบบ forward primer และ reverse
primer โดยให forward primer มีบริเวณจดจำ
เอนไซมตัดจำเพาะของ Ndel (New England
Biolabs) สวน reverse primer มีบริเวณจดจำ
เอนไซมตัดจำเพาะของ Sall (Fermentas)
(ตารางที่ 1) ใชไพรเมอรที่ออกแบบเพิ่มจำนวน
ยีน NADK1 ดวยเทคนิคพีซีอาร (Polymerase
Chain Reaction) โดยใชโคลน cDNA ที่ไดจาก
The National Institute of Agrobiological
Sciences (NIAS) เปนแมแบบ และทำการ
ตรวจสอบขนาดของชิ้นยีนดวยอะกาโรสเจล
อิเล็กโทรโฟริซิส (agarose gel electrophoresis)
นำชิ้นยีน NADK1 ที่ไดจากการเพิ่มจำนวน
มาโคลนเขาสู pTZ57R/T (Fermentas) แลวทำ
การทรานสฟอรมเขาสู E. coli สายพันธุ XL-1
Blue โดยวิธี CaCl2 จากนั้นนำเซลลที่ไดมาเลี้ยง
บนอาหารวุน LB ที่มียาปฏิชีวนะแอมพิซิลินซึ่งมี
ความเขมขนสุดทาย 100 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร
พรอมกับเติม x-gal และ IPTG นำโคโลนีสีขาว
ที่ไดมาสกัดพลาสมิดดวยวิธี Alkaline lysis
(Sambrook & Russell, 2001) และตรวจสอบ
ขนาดของชนย้ิ นดี วยอะกาโรสเจลอ  เลิ กโทรโฟร ็ ซิสิ
จากนนนำพลาสม ้ั ดทิ ได่ี มาต  ดดั วยเอนไซม  ตดจำเพาะ ั
Ndel และ Sall และแทรกชิ้นยีนเขาไปใน pET
21a(+) (Novagen) ที่ตัดดวยเอนไซมเดียวกัน
เพื่อใหเกิดการสรางโปรตีนที่มี His-tag เชื่อมตอ
อยูทางดานปลายคารบอกซิลของโปรตีนรีคอม
บิแนนต NADK1 และทรานสฟอรมพลาสมิด
รคอมบ ี แนนต ิ pET21a(+)  เขาส E. coli ู สายพนธั ุ
XL-1 Blue โดยวิธี CaCl2 แลวทำการสกัด
พลาสมิดดวยวิธี Alkaline Lysis จากนั้นนำ
พลาสมิดมาตรวจสอบชิ้นยีนที่แทรกเขาไปโดย
อะกาโรสเจล อิเล็กโทรโฟริซิส
การสรางโปรตีนรีคอมบิแนนต NAD kinase1
ใน E. coli สายพันธุ Rosetta (DE3)
นำพลาสมิดรีคอมบิแนนต pET21a(+)
มาทรานสฟอรมเขาสู E. coli สายพันธุRosetta
(DE3) (Novagen) โดยวธิ CaCl ี 2 จากนนนำเซลล ั้ 
ที่ไดมาเลี้ยงบนอาหารวุน LB ที่มียาปฏิชีวนะ
แอมพซิลินซิ งม่ึ ความเข ี มข นส ดทุ าย 100 ไมโครกรมั
ตอมิลลิลิตรเพื่อคัดเลือกโคโลนีที่มีพลาสมิด
รคอมบ ี แนนต ิ นำโคโลนทีได่ี มาเล  ยงในอาหารเหลว ้ี
LB ที่มียาปฏิชีวนะแอมพิซิลินซึ่งมีความเขมขน
สุดทาย 100 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร โดยเขยาที่
250 รอบตอนาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
เปนเวลา  16-18 ชวโมง ั่ เลยงเซลล ี้ ท ไดี่ รบพลาสม ั ดิ
ในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวจนไดคาการดูดกลืนแสง
ที่ 600 นาโนเมตร เทากับ 0.6 กระตุนใหผลิต
โปรตนรี คอมบ ี แนนต ิ โดยเต  มิ IPTG จากนนนำไป ั้
สกดโปรต ั นโดยการทำให ี เซลล  แตกด  วยคล  นเส ่ื ยงี
ความถส่ีงู (sonication) ตรวจสอบการสรางโปรต  นี
ของเซลลท ไดี่ รบพลาสม ั ดโดยว ิ ธิ SDS Polyacry- ี
lamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
ยีน ไพรเมอร ลำดับเบส ขนาด
(นิวคลีโอไทด)
NADK1 Forward 5’ -GCCCATATGTCGCTCGACGAGCTTCCGCAC- 3’ 30
Reverse 5’ -CTGGTCGACATCACGCGGGCCGTCGAATGA- 3’ 30
ตารางที่ 1 ลำดับเบสของ primer ที่ใชสำหรับการโคลนยีน NADK1 เขาสู pET21a (+)
การโคลนยีนและการสรางโปรตีนรีคอมบิแนนต NADK1 จากขาว 175
ทำใหโปรตีนรีคอมบิแนนต NADK1 บริสุทธิ์
โดยนำสวน soluble protein มาเติม 30 mM
imidazole แลวนำไปผานนิกเกิลคอลัมน (GE
healthcare) โดยลางคอลัมนดวยบัพเฟอรที่มี 30
mM imidazole จนคาการด  ดกล ู นแสงท ื ความยาว ี่
คลื่น 280 นาโนเมตร เปน baseline ชะคอลัมน
ดวยบัฟเฟอรที่มี 200 mM imidazole แลวนำมา
ผานกระบวนการ dialysis ใน 50 mM Tris-HCl
(pH7.9), 0.1 mM DTT, 0.2 mM EDTA เพื่อ
กำจัด imidazole ออก จากนั้นตรวจสอบโปรตีน
รีคอมบิแนนตโดย SDS-PAGE
การวเคราะห ิ โปรต  นรี คอมบ ี แนนต ิ ดวยเทคน  คิ
western blot
ตรวจสอบโปรตีนรีคอมบิแนนต NADK1
ดวยเทคนิค western blot analysis โดยถายโอน
โปรตีนลงสูแผน PVDF membrane (MachereyNagel)
block nonspecific ดวย 5% skim milk
และบมก บแอนต ั บอด ิ anti-His ี (GE Healthcare)
จบกั บั His6
Tag ทอ่ีณภุ มู หิองเป  นเวลา  3 ชวโมง ่ั
จากนั้นบมกับแอนติบอดี Immunoglobulin G
(Jackson ImmunoResearch Laboratories) ที่
เชื่อมตอกับเอนไซม alkaline phosphatase
(AP) ทอี่ ณภุ มู หิอง เปนเวลา  1 ชวโมง ั่ และตรวจสอบ
แอกติวิตีของ AP ดวยวิธี colorimetric โดยใช
BCIP/NBT เปนซับเสตรต
การตรวจสอบแอกติวิตีของ NAD kinase
หลังจากการแยกโปรตีนดวยเจลอิเล็กโทร
โฟริซิสใน native gel ในบัฟเฟอร Tris-glycine
(25 mM Tris, 192 mM glycine) pH 8.3 ที่มี
1 mM DTT และ 0.1 mM ATP โดยใช 7%
separating gel และ 4% stacking gel ตรวจสอบ
แอกตวิติของ ี NAD kinase ดวยว  ธิ in-gel activity ี
staining (Grose et al., 2006) โดยนำเจลมาบม
ที่ 37 องศาเซลเซียส ในสารละลาย staining
mixture ที่ประกอบดวย 2 mM nitroblue
tetrazolium, 2.7 mM phenazine methosulfate
(PMS), 0.1 M G6P, 0.5 units/μL G6PDH, 100
mM NAD, 60 mM ATP, 100 mM MgCl2
ใน 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5 โดยแบงเปนชุดที่มี
และชุดที่ไมมี NAD สวนการตรวจสอบแอกติวิตี
ของ NAD kinase จากสารละลายโปรตีนหยาบ
(crude protein) และโปรตีนที่ผานนิกเกิลคอลัมน
ทำไดโดยเติมโปรตีนใน reaction mixture ที่มี
สวนผสมของ 50 mM Tris-HCl (pH7.9), 6 mM
MgCl2 และมี 4 mM ATP และ 4 mM NAD เปน
สารตั้งตน หลังจากทิ้งใหทำปฏิกิริยา 30 นาที
ที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส หยุดปฏิกิริยาโดย
ตมเป  นเวลา  5 นาทีนำไปปนด วยความเร  ว็ 13,000
rpm นำสวนใ

ผลลัพธ์ (อังกฤษ) 1:

IntroductionNADK NAD kinase (s/s property recycle ATP: NAD ;2 '-phosphotransferase, EC 2.7.1.23) Peter : 00.Located at Cheyenne mot  Into the pixel ลั้  ot and consummate Pro rakha Yi Casa hole o Te.Studies located in flora s/s  NAD kinase Cheyenne to my  have.B  amun. By า NAD kinase is found.KOEI  bame อลัซิมขอ wakhi angok NAD + and NADP almost ngue +.(Turner et al., 2005) by NADP + have  ngachak.NAD + by the use of energy from ATP  noptikiriya .Phosphorylation (Stryer, 1995), NAD +, and.NADP + is  electron in the system on receipt.Control of metabolism in cellular reaction to iron out any, Aviv .And data from reactive oxygen species, flattened cell .(ROS) found here –  the proportion of NADP +./NAD + will.Increasing FDA  ngonwot speed  broad ten here in Shanghai here on the plants.Disease (Turner et al., 2005) in this research.Year active courses tue At NAD kinase from white cannot  (Oryzaซงเป่ึ sativa L.) plus  ชทื me yathang saraset กัจิ focus issues include.Thailand's  าน  scheduling by the si mi kasa ึ NAD kinase.In Arabidopsis yakhon  the meaning of article found.  ngakue บั NADMany types of plants found in the kinase Chea  green tomatoes.(Lycopersicon esculentum), b าว, over(Zea mays) and soybean (Glycine max), and.Find active  Te vi. hit of NAD kinase with control.Calgary's international remembrance Lin  wamot  consummate (calmodulin) วย (Turner.Et al., 2004), this experiment KOR  wayakan Crusher.Clone genes from a b  wakhe  NAD kinase1 success  pET21a.(+)-Yopla and here  ngot samit naenot  com   Suites hotel an eternal.Escherichia coli genetic Rosetta  check cableTo collect pumpkins to Pro PA  table v SDS-PAGE ี and Western works.Blot analysis to make soluble enzyme haibon  XI ์ิ thathu.By nickel column green and active  Te video hit of the NAD.- kinase อเปื่ nok page laphu  คื้ ญทัทำใหี่ Gen-eternal mind, nathan .The working mechanism of NAD kinaseHow to studyCreate table city som  dari  Nan from the brand-new component b NAD!!kinase1 (NADK1)SOP คื  -nok Makhi waphe-UNO's  aha ยื่ NADK1!!By sequencing of the genes used  and NADK1 acid.174 the Black River with  ethnic European, Nathan , and the Board of.Ahmad rahi Thi สไดั  Mano translates from Arabidopsis Copenhagen  query.Apply a sequencing cDNA of amun  b gene NAD kinase.The  came forward and reverse primer design.Forward primer primer by  provide a recognized specification cutting property recycle s/s Ndel (New England.Reverse primer walking loop Biolabs) have recognized. specification cutting property recycle s/s Sall (Fermentas).(1) support the Memphis Restaurant &   of design.Gene  wayatheknik NADK1 Jade  (Agen, consummate Polymerase PC.Chain Reaction) by shutting down the  cDNA clone from .The National Institute of AgrobiologicalSciences (NIAS), Pedro  and made  namae.Check the size of the pieces, gene  วยอะ sache flattened Hotel jade.Silicone fori electrolyte (gel electrophoresis agarose).Take slice gene NADK1 the  the number of success  pTZ57R/T came to the clone crossed (Fermentas) Lae  watham.Sofon  makhe  sink  E. coli genetic line  success XL-1.Blue by .-CaCl2, flattened at the  banquet.On wu  mountain restaurant LB with antibiotics, the maphisi hotel is activated with. focus าย  mok crossed 100 micro gram nasut suite.  aminlilit.X-gal and -porn with IPTG lead refill colony of white.The quarter  city  wayawithi Alkaline etching samit jade lysis.(Sambrook & Russell, 2001), and check the.The size of the yi peoples nice Lor  sache เลิ วยอะ Hotel โฟร็ kathon Xin XI.Six ได่ี city สม้ nanam dathi come.  .  s/s dadua yaen Sai dachampho.Ndel and Sall and  genes in pieces of eternal pET.21a. (+) (Novagen)  wayaen Sai , s/s, Impressionist-cut the same.To provide the birth  to  His-tag ngaprotin with connectors, consummate.  sur. Ta  noplai prices are prohibited for those lookin  told SI's protein com.Business naenot  NADK1 and  mopla samit sofonNan Martin pET21a rokom b (+) E. coli ู   he's พนธั line ุ.XL-1 Blue by  extraction method, the CaCl2 Lae watham.Alkaline Lysis samit  wayawithi city jade.Samit came to examine pieces of ornamental gene inserted into an eternal .A hotel flattened sache Electrolyte fori Xin'sTo consummate business naenot  com  ngaprotin NAD kinase1.In E. coli genetic Rosetta (DE3)  line.Take samit naenot  city pET21a com business (+)Report  makhe  anchovies sofon  E. coli genetic line success  Rosetta.(DE3) (Novagen) CaCl 2 ี nanam wathi six-ลั้. The  feed on the  mountain restaurant wu LB with antibiotics.The city ngamue ability เขี mok mopsi Li  Not  าย  100 micro dathu Department..  aminlilit to choose city colony with samitNan Martin  rokom b bring Cologne lone male  ได่ี t-Wen Yong in lawi.LB with antibiotics at maphisi Li   mok is activated in an eternal mountain.Most Suite 100 micro gram าย  aminlilit by the  law.Around 250.37° c temperature anathi Copenhagen 16-18 chawamo  times งั่ Le-Li Yong.  สมัดิ  ไดี่ consummate Suite boplaLiquid fuel in a meal at the hotel anhydrous   to finally absorb light.At 600 nm KRA TU  here to  production 0.6 nahaiNan Pro raton com b Te  te by six Mitsubishi IPTG nanam ไปั้.Sok dapo ใหี-flattened by ratan   wayakhon  นเสื่ yangi difference mo.Rotating snakes (sonication) check thasi to Rails Pro  PA!! ไดี่- lot of lookin bopla samat by Polyacry SDS-cystic ี.lamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)Gene sequencing, size, private e-mail or (Tai Mo.  nucleotide).NADK1 Forward 5' -GCCCATATGTCGCTCGACGAGCTTCCGCAC- 3' 30Reverse 5' -CTGGTCGACATCACGCGGGCCGTCGAATGA- 3' 30Table 1 of primer at the base sequence used for cloning genes NADK1   success  pET21a eternal (+)Gene cloning and consummate business naenot  ngaprotin com  NADK1 from b าว 175.Results  naenot  NADK1 bikini com protein purityHydro soluble protein by walking up to 30 mM.Imidazole  nanikkoen  Lae wanam column to interested mountain  (GE.The domain " ngakho healthcare) Lam  wayabap   jade green food poison that is 30.MM imidazole, until Cagayan nasaeng ทื, specialized product category  Lu Ya Pittsburgh.Wave, 280 NM Peter : 00 pm  baseline column leachingJade  wayabaf  with 200 mM imidazole food poison Lae  wanam come.From  NOK 50 mM dialysis process in Tris-HCl(PH7.9), 0.2 mM EDTA, 0.1 mM DTT, so.Get rid of imidazole, and then check for protein.Com naenot  by the SDS-PAGE bikiniThe hi Pro  & PA wakhro comfort wayathe men Nan Te mo.  b- Ki.western blotCheck the business naenot  com NADK1 proteinWestern blot analysis by Jade  wayatheknik Rd.  yaon.Protein into a distinctive  hotel  PVDF membrane phae (MachereyNagel) วย block nonspecific 5% skim milk, carbonated.And ี bamok  baae natap anti-His (GE Healthcare), clay.End of the His6 กับั Hiongpe  nawela ทอี่ naphu Mu Tag  3 chawamo PLE.Then feel free to  with Immunoglobulin G antibody(Jackson ImmunoResearch Laboratories)Links   akap property recycle tons of alkaline phosphatase, s/s.(AP) ทอี่ naphu Mu   1 chawamo time Copenhagen hiong งั่, and check the.AP's active Te vi  wayawithi jade colorimetric publication by shutting down .BCIP/NBT Pedro  nasap set PAActive monitoring of NAD kinase Te video hit.After the separation of protein  wayache call ลอิเล็ก mo.Silica gel in native Buffalo fori food poison  Tris-glycine.(25 mM Tris, 192 mM glycine) with pH 8.3.0.1 mM DTT and 1 mM ATP used  by 7%.4% stacking gel gel and separating checkedMartin NAD kinase twi cannot force ดวยว  in-gel activity ี works.Staining (Grose et al., 2006) by j. lamap  s/s.At 37 degrees Celsius. In the staining solutionGrind the mixture that is 2 mM nitroblue  วย KOR.tetrazolium, 2.7 mM phenazine methosulfate(PMS), 0.1 M G6P, 0.5 units/μL G6PDH, 100mM NAD, 60 mM ATP, 100 mM MgCl2In 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5 by Barry   nachut with ngape.And here is where my NAD  audit tornado force Te video hit.NAD kinase from aqueous solution of crude protein(Crude protein) and proteins from green   nanikkoen column.Make directory  by reaction with filled protein mixture.Here a loop of 50 mM Tris-HCl (pH7.9), 6 mM.There are 4 mM MgCl2, and 4 mM ATP and NAD  Peter Green.Hotel  San set. After leaving  react 30-minute disruption.At a temperature of 25° c, the reaction is stopped by the.Tom is the  nawela  five minutes brought to Remy    up blend, jade ว็ 13000.Rpm brought walking loop

ผลลัพธ์ (อังกฤษ) 2:

Introduction
enzyme NAD kinase (NADK; ATP: NAD the
2'-phosphotransferase, EC 2.7.1.23) is the 
 TS enzyme found in the cell, where both pro and breaks Haute  Carmi Carmi clients. Haute remove
the enzyme  NAD kinase in plants is not  with
the  information much by its  the NAD kinase is
overlap between the regions Kong 's metabolizing're Sim pulled NAD +. and NADP +
(Turner et al., in 2005) by NADP + Create  away from
NAD + using  energy ATP through  the reaction
phosphorylation (Stryer, 1995) NAD + and
NADP + is  the electron acceptor important in
metabolizing. Metabolism Controlled reactions left  cells 
and  prevent cell  from reactive Oxygen species
(ROS) were also  the percentage  part of NADP +
/ NAD + will
rise  rapidly than  value.  than ten times during the  a plant
disease (Turner et al., 2005) in this research is
a student transfers torque to pull makes no criticism of NAD kinase from the white (Oryza
sativa L.) Zong. Epeึ Dr.  The Christian Science is focusing on no major economic power methods registers
of Thailand by a previous  the  the ice None Education deeper NAD kinase
in Arabidopsis find glistening  a similar color to a person  Dong Geun butter. NAD
kinase found in many plants such  tomatoes
(Lycopersicon esculentum), the  the news, the  of corn
(Zea mays) and soybean (Glycine max) and
found  the actin activity of NAD kinase is. Control
of Calgary Modular Lynn (calmodulin) the  the ants  with (Turner
et al., the 2,004th) This experiment consisted  with the
cloned gene NAD kinase1 from the  or attend  on to . PET21a
(+) and  the road  the plasmid recombinant sub  the  on to the
Escherichia coli strain  Rosetta check
the track pro at  by the transmission Works SDS-PAGE. transmission and Western
blot Analysis of soluble enzyme, the company  ultimate Hu Si
by nickel column  and measurement actin activity of NAD
kinase Perry is almost beside  with  the pool base for the title role Tulsa. Thus, where the  the mind 
mechanism of NAD kinase
and methods
to track plasmoid  trip Planet's no Canaan, the statistics from a  this NAD
Kinase1 (NADK1)
arose subconsciously read  with 's. The clients Noam b None of the Pension  the missing title this NADK1
using  sequencing of genes NADK1 and acid sequence
174 THANYAPORN  father outcomes for  happiness and of
a concept for hotels translations of the vehicle on the day. From  Arabidopsis be  query
led the  information sequenced cDNA gene NAD kinase
that has  design forward primer and Reverse
Primer by the  forward primer with a memorable
enzyme  cut Specifications Ndel (New England
Biolabs). The  the reverse primer with a recognition
of the specific enzyme  cut Sall (Fermentas)
(Table 1) using primers   designed to increase the number
of genes NADK1  a PCR process . (Polymerase
Chain Reaction) using  cloned cDNA at the  from
The National Institute of Agrobiological
Sciences (NIAS) is  Mateo  and to
determine the size of the gene's  an agarose gel
electrophoresis. River City (agarose gel electrophoresis)
pieces gene NADK1 at the  of the increasing number
cloned into  on to  pTZ57R / T (Fermentas) and  that made
​​the trans form  into that  on to  E. . coli strains, the XL-1
Blue by CaCl2 Then the cells  at the  fed
on food Vung  at LB with antibiotics Amtrak pin silicon, which is
an important  b  the end.  the 100 microgram per  ml
blessing  with the addition of x-gal and IPTG led colony of white
at the  extracted plasmid the  a way Alkaline lysis
(Sambrook & Russell, 2,001th) and check. The
size of the Hercules well an agarose gel for  Muñoz call Aphrodite cool synthesizer music
from leading plasma across the partitions Mitts promote deeper into the  the Dua enzymes  the  the specification. Whether
Ndel and Sall and inserted gene fragment into  of the pET
21A (+) (Novagen) to cut  an enzyme  same
to the  the creation  the protein with His-tag connection . The
United  way  the end Carmi  said Silva of protein recompile
BUSINESS Nancy T.  NADK1 and trans form  the plasmid
The Planet's no Nancy's stats pET21a (+). He's   E. coli  clients late May and December every 
XL-1 Blue by CaCl2 and  The extracted
plasmid the  a way Alkaline Lysis then
plasmids to determine gene fragment. Inserted into the  by
agarose gel. Electrophoresis was mafic
to create  the recombinant protein treatment  NAD kinase1
in E. coli strains  Rosetta (DE3)
led recombinant plasmid regard . pET21a (+)
coming into the trans form   on to  E. coli strains Rosetta
(DE3) (Novagen) by the Works CaCl 2 None of the leading cell Belmopan 
at the  come on. Food Vung  at LB with antibiotics
Amp Sim Lin Xing dark Concentration teams of the  Ms.  the massacres, the  100 micro arm against
the  ml for selection of colonies that have adhesives. Middlesbrough
The comments on there, Nancy, the City  pitiful alone Mitts promote deeper Malaysian  Lyon in a liquid vehicle
LB with antibiotics Amtrak pin silicon, which is the  b  the
last  the 100 mcg treatment. ml  By law, the  at
250 Rpm  min at 37 ° C
the time Shore  16-18 hours across all the cells League North  Mitts promote deeper  The Company's plasma
in broth until the liquid  the  the suction. Optical Density
at 600 nm pour  with a 0.6 boost  of the  produce
pro their recompile the gear Nancy's stats by State  is IPTG from morning to both
of the pro's Day by making the transmission. cell  break the  a similar  lines almost at Changi
to take four snakes (sonication) Check the rail project to  this
cell for  Mitts promote deeper the  the plasma plunger by vitamins Works SDS. None Polyacry-
lamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
gene sequencing primers  size
(nucleotides, the Tides)
NADK1 Forward 5 '-GCCCATATGTCGCTCGACGAGCTTCCGCAC- 3' 30
Reverse 5 '-CTGGTCGACATCACGCGGGCCGTCGAATGA- 3' 30
Table 1 sequencing primer used.  for gene cloning NADK1 the  on to  pET21a (+)
gene cloning and the creation  the protein recombinant sub  NADK1 from the  Page 175
make  protein recombinant sub . NADK1 purified
by a total soluble protein  fill 30 mM
imidazole  then be subjected to  through the nickel column . (GE
Healthcare) by the  the column  the  a buffer  containing 30
mM imidazole until the value of the  the mechanical zero light guide lengths The
wave 280 nm is  the baseline. Column leach 
the  a buffer containing 200 mM imidazole and   that brought
 through the process in 50 mM Tris-HCl dialysis
(PH7.9), 0.1 mM DTT, 0.2 mM EDTA. To
get rid of imidazole then check out proteins
by recombinant sub . SDS-PAGE
analysis of the statistics produced by the  recompile the gear Nancy  the shutdown with only one 's
western blot
check recombinant protein treatment . NADK1
the  a technique western blot analysis by taking  transfer
protein into  sheet  a PVDF membrane (MachereyNagel)
Block nonspecific knife  with 5% skim milk
and KU 's Ann plunger permanently remove anti. -His kids (GE Healthcare)
end Gus butter His6
Tag E. Moose Lahiri must be afforded at the time  Beach  3 hours throughout
the  with the antibody. Immunoglobulin G
(Jackson ImmunoResearch Laboratories) that
connect  to enzymes, the alkaline phosphatase
(AP) E at Bhubaneswar Smooth Lahiri want  the time  1 g h around and check
actin activity of AP's . The colorimetric method using the
BCIP / NBT. The  Subprik State citrate
monitor actin activity of NAD kinase
after separating proteins by  a gel electrolyte
Four River City in native gel in buffer the Tris-glycine
(25 mM Tris. , 192 mM glycine) pH 8.3 containing
1 mM DTT and 0.1 mM ATP using the 7%
separating gel and 4% stacking gel monitor
the yoke of Victor Martinez's no NAD kinase The unit  Works in-gel activity no
staining. (Grose et al., 2006) by Brian  the gel
at 37 ° C in staining solution
mixture. Consisting  with 2 mM nitroblue
tetrazolium, 2.7 mM Phenazine Methosulfate
(PMS), 0.1 M G6P, 0.5 Units / ΜL G6PDH, 100
mM NAD, 60 mM ATP, 100 mM MgCl2
in 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5 by. Blackburn  send  series with
and without  with NAD's  of monitoring actin Activity
of NAD kinase solution crude protein
(crude protein) and proteins through  the nickel column .
 done by adding a protein in the reaction mixture containing
50 mM Tris and mixtures -HCl (PH7.9), 6 mM
MgCl2 and 4 mM ATP and 4 mM NAD is  the
substance of the packet . After leaving the reaction  30 minutes
at a temperature of 25 degrees Celsius stops the reaction by
the quagmire  time  5 minutes to mingle with the Red   the Chippewas 13,000
RPM bring  of purchase.

ผลลัพธ์ (อังกฤษ) 3:

Introduction of Simon kinase (NADK
NAD; ATP: NAD.
2 '- phosphotransferase EC 2.7.1.23), 2002
lean ไซมท. Found that in cells that, pro buildings, respectively. Oat, and,, building Yu oat.
study. NAD lean Simon kinase in plants also have its ratings
B so much information. By Boston. NAD kinase is
.เกยว B. Young 2005, metabolism,, SIM, and is NAD NADP
(Turner et al, 2005) by NADP rating of
NAD by using its power ATP ผ work
phosphorylation reaction. (Stryer 1995), NAD and
NADP 2002 oxidant in critical systems
metabolism. Reaction control rolling อกซ market in cill.
.A singer and model cell consists of reactive oxygen species
(ROS) by the Boston its tighter diversification of NADP

/ NAD will increase relatively fast loans ten competition between plants in 2002
disease. (Turner et al, 2005) in this paper
era education แอกต. วิติ. Of color NAD kinase from its white (Oryza
sativa L.The song is Dr.) no, no, ชทื for Eric has the economic, trade, Chi
by gun. Its work. And there is air.). NAD kinase
Arabidopsis found in its articles, Claude Color line canal. งกึ card NAD
kinase found in many plants, Che prescription, tomato
(Lycopersicon esculentum), of its long, of its corn girl
.(Zea mays) and soybean (Glycine max) and
found its yoke ติวิ integrability NAD kinase control
of Calgary modulus Lin (calmodulin) วมด leverage its. (Turner
et al, 2004) this experiment consists of its director
NAD kinase1 from its gene clone of a high rating their pET21a
.(a) and 2002 งถ rating plasmid the combi แนนต from their high ratio
Escherichia coli genetic lines. Rosetta check
to produce proton ratio on โดยว AG. SDS-PAGE. And the Western
blot analysis doing soluble enzyme ใหบร. สิทธุ post I
by nickel column, its measurement ติวิ and yoke of NAD
.Kinase per PE wake of qualify and its data base for pool, water, ญทั made, color, their mind. 2005
mechanism of NAD kinase

how education to produce plastic. Its drill. COM,. แนนต. From, respectively. This NAD
kinase1 (NADK1)
สบคื of its environment. องจ of MoO โนมข AB Ao Phe, its content, so, this NADK1
.By using a sequence of gene and its NADK1 acid sequence
174 ธันย. Father's addressed its happy and faculty
a mano.. translated code, color, สได. From its Arabidopsis Spain qualify query
B. The data sequence. CDNA gene NAD kinase
that its design and forward primer reverse
primer by loans forward primer area is remembered
.Lean Simon. Genomic of Ndel (New England
Biolabs) diversification reverse primer area is remembered
lean Simon. Genomic of Sall (Fermentas)
(table. 1) from its primer design. The
gene NADK1 market and its technical aspects. (PC Polymerase
Chain Reaction) by using its ratings from the mud cDNA
.The National Institute of Agrobiological
Sciences (NIAS) in 2002. The macro demand
check the size of the market and its pieces gene check agarose gel electrolyte โฟริ
sis. (agarose gel electrophoresis)
the pieces at its NADK1 gene from the
cloning their high ratings pTZ57R / T (2004) and Fermentas do
.The team ran สฟ Orn. Their high ratings E. Coli genetic line. XL-1
Blue by way of CaCl2 the cells 2004 2005 raise
on food's securities LB with antibiotics ampicillin silicone, which has their securities concentrated
the last line of its financial 100 UG ml
blessing along with its fill. And the colonies X-gal IPTG white
.The ratings to bite plasmid market and its way Alkaline lysis
(Sambrook & Russell 2001), and check the size of the ชนย
you. San Diego Huai check rose เจลอ 2005 love, called Aphrodite. . ซิสิ
from this hast brought forth. ดทิ. It has all of its ดดั Huai lean, Simon. And its specific.
Ndel Sall แทรกชิ้น and and their genes to pET
.21a () (Novagen), cut market and its strategy, lean Simon same
to its profitability was rating at a protein with His-tag connect its rating on its
is work late building. Tell SIL protein composition
Bi แนนต respectively. NADK1 tran สฟ Orn. มพล and the mid
party อมบ HWI แนนต. PET21a (). He is E its ratings. Coli line open cereals e
. Its.XL-1 Blue by way of CaCl2 and 2004 were extracted
plasmid market and its way Alkaline Lysis the
plasmid check piece insert their genes to agarose gel by
? Electrode fo RI SIS
rating at protein the combi แนนต. NAD kinase1
in E. Coli genetic lines. Rosetta (DE3)
.The mid the combi แนนต hast brought forth from pET21a (a)
upon work สฟ Orn. According to their high operating E. Coli genetic lines. Rosetta
(DE3) (Novagen) by วธิ CaCl has 2 from this the cells. That. Its ratings to
that feed on food's securities LB with antibiotics
แอมพ silicone hand. Doesn't. The writing, concentrated its two, all its. Its 100 micro enterprise it
.Its ml to select the colony with plasmid
party อมบ HWI แนนต. The Colo River has its. It. Come on 2005 Yong in liquid medium. An
LB with antibiotics ampicillin silicone, which is their most concentrated securities
development 100 line. Its amino alli L.! By law, however the
.250 around its analog temperature 37 C
Spain once time. 16-18 schwannoma o'clock. There to do it properly. This cell, the competition, debt service บพลาส D. The
in liquid medium and its C its absorbance
that 600 nm. Competition with the events 0.6 securities loans produce
.Protein, com., แนนต. By Tay. Mi IPTG from this lead. I
protein level. By doing to color cells 2005 แตกด 2004, 2005. The,,, and. ยงี
the ถส Gallery color snake (sonication). Check the produce proton. This
of cells. The competition, debt service, see las.) โดยว. Thi SDS Polyacry color
lamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
.Gene primer sequence. Its size
(nucleotides.)
NADK1 Forward 5 '- GCCCATATGTCGCTCGACGAGCTTCCGCAC - 3' 30
Reverse 5 '- CTGGTCGACATCACGCGGGCCGTCGAATGA -. 3 '30
Table 1 sequence used for primer TA cloning NADK1 their high ratings pET21a (a)
.Cloning and rating at protein the combi แนนต. NADK1 from B. 175 girl
do loans protein the combi แนนต. NADK1 pure
โดย the diversification soluble protein. Fill 30 mM
imidazole and 2004 the director neighbourhood nickel column rating (GE
healthcare) โดยล 2001 column its charge with its node. 30
.MM imidazole until Kagawa acid receivables ดกล mu in the light, that
wave length 280 nm. 2002 baseline leach column.
market and its บัฟเฟอร. With 200 mM imidazole. After 2004 bring
I. neighbourhood dialysis process in 50 mM Tris-HCl
(pH7.9), 0.1, mM DTT 0.2 mM EDTA to
get rid of imidazole out. Then check the protein
.The combi แนนต rating by SDS-PAGE
the long peninsula. 2004, proton. Gynecology. Com., แนนต. Its productive capacity, the 2005 ki

Western blot check protein the combi แนนต. NADK1
market and its techniques. Western blot analysis โดยถ rating down its plan of high protein transfer
prescription on PVDF membrane (MachereyNagel)
block nonspecific market and its 5% skim milk
.บมก, and its แอนต. Blind. Anti-His (GE Healthcare)
end under the card His6
Tag woven there ณภ. Mu. The expulsion of two PE. Time, qualify 3 schwannoma o'clock, ั
then found its mark with the antibody. Immunoglobulin G
(Jackson ImmunoResearch Laboratories)
welding bar on its ratings with Simon alkaline phosphatase
.(AP) woven. ณภ. Mu. The expulsion of two of its time. 1 Spanish schwannoma o'clock. There and check
yoke ติวิ integrability AP market and its colorimetric method by ใช
BCIP / NBT 2002 mop "- Business
inspection ติวิ back yoke. NAD kinase
after protein separation market and its gel electrolytes
photo's way of native gel ในบัฟ charge. Tris-glycine
.(25, mM Tris 192 mM glycine) pH 8.3 with
1 and mM DTT 0.1 mM ATP by using its 7%
separating gel 4% stacking and gel check
yoke coded contact. Color NAD kinase too. Its color. In-gel activity
staining (Grose et al, 2006) by the gel to receive the 37
C) in aqueous solution staining
mixture. Composite market and its 2 mM nitroblue
.Tetrazolium 2.7 mM, phenazine methosulfate
(PMS), 0.1, M G6P 0.5 units / thermal L, G6PDH 100
mM NAD 60 mM, ATP 100 mM, MgCl2
in 0.1 M. Tris-HCl pH by BAE, 7.5 its 25-year series
and the ratings are NAD diversification examination tutor of NAD yoke have
kinase from aqueous solution and crude protein
.(crude protein) and protein through the neighbourhood nickel column.
do ratings by adding protein in reaction mixture with
diversification mix of 50 mM Tris-HCl (pH7.9), 6 mM
MgCl2. And 4 mM ATP 4 mM and NAD 2002
substance set TA. After leaving its profitability, reaction 30 minutes
.At 25 C stop reaction by
Tom PE. Time, qualify 5 min and ปนด . The Rae 2005, avant, 13 000
RPM bring diversification.