3. การจำแนกชนิดแบคทีเรีย ศึกษาลักษณ

3. การจำแนกชนิดแบคทีเรีย
ศึกษาลักษณะโคโลนีของแบคทีเรียสาเหตุโรคที่แยกได้บนอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดต่างๆเพื่อใช้ในการจำแนกลักษณะ โดยอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ทดสอบประกอบด้วยอาหารเลี้ยงแบคทีเรียทั่วไป ได้แก่ NA, yeast extract dextrose-calcium carbonate agar(YDC) และอาหารกึ่งเลือกจำเพาะที่ปรับปรุงสำหรับแบคทีเรียที่เป็นสาเหตุโรค คือ อาหาร KB+5%Nacl+ antibiotic (cycloheximide) (สำนักงานมาตรฐานสินค้าเกษตรและอาหารแห่งชาติ,2551) และศึกษาคุณสมบัติชีวเคมีเบื้องต้นตามวิธีมาตรฐาน ได้แก่ Levan formation, potato soft rot, starch, gelatin, urease, motility, citrate utilization, lipolytic activity, and carbon utilization เป็นต้น โดยใช้ข้อมูลพื้นฐานจากตำรา Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 10th ed ในการจำแนกชนิดเชื้อ
4. การจำแนกชนิดของเชื้อแบคทีเรียโดยการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ ( DNA Sequence )
นำเชื้อแบคทีเรียแกรมลบที่ชักนำการเกิดปฏิกิริยาการตอบสนองอย่างเฉียบพลันบนใบยาสูบและก่อโรคบนใบข้าวโพดข้างต้น นำมาจำแนกโดยการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ ด้วยวิธี DNA sequences โดยใช้ universal primer 6F (GGAGAGTTAGATCTTGGCTCAG) และ 1510R (GTGCTGCAGGGTTACCTT GTTACGACT) (van der Meer et.al,1998)16s rDNA ของเชื้อแบคทีเรียสาเหตุโรคพืช (Proteobacteria) โดยทำปฏิกิริยาในปริมาตรรวม 25 ไมโครลิตร (ดีเอ็นเอ 25 ng ,dNTPs 1 mM ,Taq DNA polymerase enzyme 1 unit ,MgCl2 2.5 mM ,ไพรเมอร์ (6F และ 1510R) 1 µM ,10X PCR buffer 2.5 µl และนํ้ากลั่นนึ่งฆ่าเชื้อ) กำหนดปฏิกิริยา PCR โดยใช้ Predenaturation ที่ 95 oc (5 นาที) denaturing 95 oc เป็นเวลา (1 นาที) annealing 56 oc (1 นาที) และ extension 72 oc (1 นาที) จํานวน 30 รอบ นำ PCR product ที่ได้ตรวจดูภายใต้แสง UV transilluminators ที่ความยาวคลื่น 312 นาโนเมตร พร้อมทำการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ ด้วยวิธี Sequence analysis (Biodesign) นำข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ได้มาวิเคราะห์เปรียบเทียบกับนิวคลีโอไทด์ในฐานข้อมูล Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)โดยโปรแกรม BLAST และ Alignment ClustalX เพื่อจำแนกหาความใกล้ชิดของเชื้อเป้าหมาย

ผลลัพธ์ (อังกฤษ) 3:

3. Identification of bacteria
. The characteristics of colonies of diseases caused by bacteria isolated on various types of media to use in the population characteristics. By the medium used to test consists of common bacteria were cultured, NAYeast extract dextrose-calcium carbonate agar (YDC) and food semi selective improved for bacteria that can cause disease. Food KB 5%Nacl antibiotic (cycloheximide). (National Bureau of agricultural and food standards.2551) and characterization of biochemistry by standard methods, namely, Levan formation potato soft rot starch gelatin urease,,,,, ,, motility citrate utilization lipolytic activity and carbon utilization, etc. by using basic data from the Bergey s Manual. ' Of, Determinative Bacteriology10th ed in identification of
4. Identification of bacteria by nucleotide sequencing (DNA Sequence)
.The Gram-negative bacteria induced reaction response to acute on tobacco and ก่อโรค on corn leaf above. Brought by nucleotide sequencing method using DNA sequences universal primer 6F (GGAGAGTTAGATCTTGGCTCAG). 1510R.GTTACGACT) (van der Meer et.Al 1998), 16S rDNA of bacterial plant diseases caused by (Proteobacteria) reaction in the total volume of the 25 (DNA 25 ng. DNTPs 1, mM Taq DNA, polymerase enzyme, 1 unit MgCl2 2.5 mM, the primer (6F 1510R) tracks, and 1 M 10X PCR buffer 2.5 tracks and distilled water l sterilized) determine the reaction PCR using Predenaturation that 95 OC (5 minutes) denaturing 95 OC for 1. Minutes) annealing 56 OC (1 minutes) and extension 72 OC (1 minutes) the number of 30 around the PCR product to check under the light UV transilluminators. The 312.The analysis of nucleotide sequence with the method Sequence analysis (Biodesign) the nucleotide that were analyzed and compared with the nucleotide in the database. Genbank (http:/ / www.ncbi.nlm.nih.gov /) by the program BLAST Alignment ClustalX and to classify the close of target
.