2. Material and methods2.1. Materia

2. Material and methods
2.1. Materials
The rice protein isolate (Oryza sativa L.) was obtained from EnerGenetics International, Inc. (Keokuk, IA). Protease Validase FP concentrate and Alkaline Protease concentrate was kindly provided by Valley Research Corporate (South Bend, IN). Neutral Protease (NP) was provided by Bio-CAT Inc (Troy, VA). Val is a fungal peptidase complex produced by submerged fermentation of a selected strain of A. oryzae and contains both endoprotease and exopeptidase activities. The AP is a serine alkaline protease prepared from B. licheniformis which possesses endopeptidase activity. The NP is an extracellular endopeptidase produced from B. subtilis. These enzymes are active in the neutral pH range. These proteases were selected because they have been commonly used in industrial processes with high-quality thermostability. Fluorescein, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox ), and DPPH were purchased from SigmaeAldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). 2,20-azobis(2-amino-propane) dihydrochloride (AAPH) and 2,20-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt was purchased from Wako Chemicals (Richmond, VA). All other chemicals and solvents were of analytical or HPLC-grade. The ultrafiltration system (Model No. 8050) and cellulosemembranes for the preparation of protein hydrolysates were purchased from Millipore Co. (Billerica, MA).
2.2. Preparation of rice protein hydrolysates
Three microbial proteases, Val, AP, and NP, were used to hydrolyse the rice protein isolate according to the peptide guidelines from the manufacturer with slight modification. The protein was first suspended and homogenized in water at 50 g/500 g and then hydrolysed by the individual proteases at a concentration of 1 g/50 g (enzyme/substrate). The enzymatic hydrolysis was conducted for 6 h in a water bath at 55 C under shaking. For Val and NP, the reaction mixturewas adjusted to pH 7.0 using 0.5 mol equi/L NaOH or 0.6 mol equi/L HCl during hydrolysis. For AP, the solution was adjusted to the optimum pH 10. The enzymatic reactions were terminated by boiling the mixtures for 5 min. Each mixture was centrifuged at 15,000 g and the soluble fraction was then filtered using filtration paper (Whatman 4) for further fractionation.
2.3. Determination of the degree of hydrolysis (DH)
The DH of rice protein by the three proteases was determined via the trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) reaction according to a previously established protocol (Zhang, Li, & Zhou, 2010).
2.4. Fractionation of protein hydrolysates by ultrafiltration
The collected protein hydrolysates were ultra-filtered sequentially using a Millipore 8050 ultrafiltration unit through cellulose membranes with different molecular weight (MW) limits. The hydrolysates were diluted with water and ultra-filtered through a membrane with 10 k Dalton (kDa) molecular weight-cut-off (MWCO) under 276 kPa nitrogen gas to afford two fractions: retentate (fraction 1, F1, represented hydrolysates >10 kDa) and permeate (MW < 10 kDa). The permeate was further ultra-filtered through a 3 kDa MWCO membrane to obtain the second retentate (fraction 2, F2, represented hydrolysates between 3 and 10 kDa) and permeate. The permeate was further ultra-filtered through a 1 kDa MWCO membrane to yield the third retentate (fraction 3, F3, represented hydrolysates between 1 and 3 kDa) and permeate (fraction 4, F4, represented hydrolysates

ผลลัพธ์ (แอฟริกา) 1:

2. Materiaal en metodes
2.1. Materiaal
Die proteïen isoleer Rice (Oryza sativa L.) is verkry uit EnerGenetics International, Inc. (Keokuk, IA). Protease Validase FP konsentreer en Alkaline Protease konsentraat is goedgunstiglik deur Valley Navorsing Korporatiewe (South Bend, IN). Neutrale Protea (NP) is verskaf deur Bio-CAT Inc (Troy, VA). Val is 'n swam peptidase kompleks wat deur onderwater fermentasie van 'n geselekteerde stam van A. oryzae en bevat beide endoprotease en exopeptidase aktiwiteite. Die AP is 'n serien alkaliese protease bereid om van B. licheniformis wat beskik oor endopeptidase aktiwiteit. Die NP is 'n ekstrasellulêre endopeptidase vervaardig uit B. subtilis. Hierdie ensieme is aktief in die neutrale pH-reeks. Hierdie proteases is gekies omdat hulle algemeen gebruik in industriële prosesse met 'n hoë-gehalte thermostability. Fluorescein, 6-hidroksi-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboksielsuur (Trolox), en DPPH is aangekoop van SigmaeAldrich Chemical Co (St. Louis, MO, USA). 2,20-azobis (2-amino-propaan) dihydrochloride (AAPH) en 2,20-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic suur) diammonium sout is aangekoop vanaf Wako Chemicals (Richmond, VA). Alle ander chemikalieë en oplosmiddels was van analitiese of HPLC-graad. Die Ultra System (Model No 8050) en die voorbereiding van proteïen gehydrolyseerde was Cellulosemembranes vir Gekoop uit Millipore Co (Bill Rica, MA).
2.2. Voorbereiding van Rice proteïen gehydrolyseerde
Drie Mikrobiese proteases, Val, AP, en NP, is gebruik om hidroliseer Die Rice proteïen isoleer die peptied volgens riglyne van die vervaardiger met effense verandering. Die proteïen is vir die eerste opgeskort en gehomogeniseerd in water by 50 g / 500 g en dan gehidroliseer deur die individu proteases teen 'n konsentrasie van 1 g / 50 g (ensiem / substraat). Die ensimatiese hidrolise is gedoen vir 6 uur in 'n waterbad by 55 C onder skud. Vir Val en NP, die reaksie mixturewas aangepas om pH 7.0 die gebruik van 0,5 mol equi / L NaOH of 0,6 mol equi / L HCl tydens hidrolise. Vir AP, was die oplossing aangepas om die optimum pH 10. Die ensiemreaksies deur kokende die mengsels vir 5 min beëindig. Elke mengsel is gecentrifugeerd by 15.000 G en Die oplosbare fraksie toe gefiltreer behulp FILTRATION Paper (Whatman 4) vir Verdere fraksionering.
2.3. Die bepaling van Graad van hidrolise (DH)
Die DH van die drie Rice proteïen deur proteases is bepaal deur die Trinitrobenzenesulfonic suur (TNBS) Reaksie volgens 'n voorheen gevestigde protokol (Zhang, Li, & Zhou, 2010).
2.4. Fraksionering van proteïen gehydrolyseerde deur Ultrafiltrasie
die versamelde proteïen gehydrolyseerde was agtermekaar Ultra-gefiltreer deur 'n Millipore Ultrafiltrasie Eenheid 8050 Deur Sellulose membrane met verskillende molekulêre gewig (MW) grense. Die gehydrolyseerde is verdun met water en ultra-gefiltreer deur 'n membraan met 10 k Dalton (kDa) molekulêre gewig-cut-off (MWCO) onder 276 kPa stikstofgas twee breuke te kan bekostig: retentate (fraksie 1, F1, verteenwoordig gehydrolyseerde> 10. kDa) en deurdring (MW <10 kDa). Die permeat verdere ultra-gefiltreer deur 'n 3 kDa MWCO membraan die tweede retentate te bekom was (fraksie 2, F2, verteenwoordig gehydrolyseerde tussen 3 en 10 kDa) en deurdring. Die permeat verdere ultra-gefiltreer deur 'n 1 kDa MWCO membraan die derde retentate te lewer was (fraksie 3, F3, verteenwoordig gehydrolyseerde tussen 1 en 3 kDa) en deurdring (fraksie 4, F4, verteenwoordig gehydrolyseerde <1 kDa). Retentates en deurdring al gevriesdroogde en is op 20 C tot verdere gestoor
analise.
2.5. Meting van die suurstof Radikale absorbansie Kapasiteit (ORAC)
Die ORAC toets is gedoen om te kineties meet Peroxylradical Die aas aktiwiteit van Antioxidant peptiede met Trolox as die standaard (Hogan, Zhang, Li, Wang, & Zhou, 2009). Fluorescein is gebruik as die fluorescent ondersoek en die peroxyl radikale is gegenereer uit AAPH in 75 mmol / L fosfaat buffer (pH 7.4). Die ORAC waarde is uitgespreek in mikromol van Trolox ekwivalente per gram droë gewig gehydrolyseerde (mmol TE / G).
2.6. Meting van DPPH aas aktiwiteit
Die toets is vroeër berig geskied volgens na die stal Die prosedure met behulp DPPH (Zhou, Yin, & Yu, 2005). A reaksiemengsel met 100 ml van elke monster en 100 ml van 0.2 mmol / L DPPH oplossing voorberei. Die absorbansie gemeet teen 517 Nmwas Teen 'n leë van deionized water by 40 min en 50 mmol / L askorbiensuur en BHT is gebruik vir 'n vergelyking.
2.7. Meting van Abts aas aktiwiteit Þ
Die toets is uitgevoer volgens 'n voorheen gerapporteer protokol (Zhou, Laux, & Yu, 2004). Abts þ is voorberei deur oksiderende 'n 5 mmol / L waterige oplossing van Abts met mangaandioksied by kamertemperatuur vir 30 min. Die reaksiemengsel vervat 1.0 ml van Abts þ met 'n aanvanklike absorbansie rondom 0,7 by 734 nm en 80 ml ​​van die proteïen gehydrolyseerde of Trolox as 'n antioksidant standaard. Die absorbansie is gemeet teen 734 NM Die volgende 1 min reaksie, en Die Trolox Ekwivalente is bereken met behulp van 'n standaard Curve Voorberei met Trolox.
2.8. Die gevolge van die gekose bepaling proteïen gehydrolyseerde op lipied oksidasie Vleis
Die hidrolisaat breuke met 'n sterk ORAC of DPPH aas aktiwiteite is gekies en antioksidant aktiwiteit teen verdere Aangeslane vir hul lipied oksidasie in grond beesvleis. Vars vleis afwerking is uit die plaaslike kruidenierswinkel en grond deur 'n plaat. Die vleis monsters (250 g) is verder gehomogeniseerd met of sonder die proteïen gehydrolyseerde deur 'n makro-ultrafine kragopwekker en in 50 ml centrifuge buise geplaas, geweeg en gecentrifugeerd vasgevang lug te verwyder. Lipied oksidasie te bevorder, is die vleis mengsel gekook om 'n interne temperatuur van 71 C in 'n water bad. Die interne temperatuur is gemonitor deur 'n naalden thermo plaas in die warm sentrum van die buise tydens kook. Na afkoeling tot kamertemperatuur, is die gehomogeniseerd en gaar vleis monsters in bak geplaas is, bedek met PVC film, en gestoor word op 4 C. Die omvang van lipied oksidasie in elke vleis monster is bepaal deur die thiobarbituric suur stowwe (TBARS) toets op. dae 1, 8, en 15 post kook (Hogan et al., 2009). Die Finale TBARS Valuewas Die berekende standaard kurwe en uitgedruk mg Soos van malondialdehyde (MDA) ekwivalente Per kg monster (MDA Ekwivalente mg / kg).
2.9. Statistiese analise
Die gemiddelde waardes is vergelyk met behulp van 'n Twosample Binne elke toets T-toets. Data word aangebied as gemiddelde SD (standaardafwyking). Verskil was beskou statisties beduidende wanneer die P waarde was <0.05 (SPSS vir Windows, weergawe 10.0.5., 1999). 'N twee-tailed Pearson korrelasie toets is uitgevoer om die korrelasies tussen middel te bepaal.